При обратимом ингибировании происходит образование. Необратимое ингибирование. Конкурентное обратимое ингибирование

⁰

1. Под термином «ингибирование активности ферментов» понимают специфическое снижение каталитической активности, вызванное определенными химическими веществами - ингибиторами.

Ингибиторы представляют большой интерес для выяснения механизмов ферментативного катализа, помогают установить роль отдельных ферментативных реакций в метаболических путях организма. В основе действия многих лекарственных препаратов и ядов лежит принцип ингибирования ферментативной активности.

2. Ингибиторы способны связываться с ферментами с разной степенью прочности. На основании этого различают обратимое и необратимое ингибирование. Обратимые ингибиторы связываются с ферментом слабыми нековалентными связями и при определенных условиях легко отделяются от фермента:

Е + I ↔ EI .

Необратимое ингибирование наблюдается в случае образования ковалентных стабильных связей между молекулой ингибитора и фермента:

Е + I → E-I .

3. По механизму действия обратимые ингибиторы подразделяются на конкурентные и неконкурентные.

Конкурентное ингибирование вызывает обратимое снижение скорости ферментативной реакции в результате связывания ингибитора с активным центром фермента, которое препятствует образованию ферментсубстратного комплекса. Такой тип ингибирования наблюдается, когда ингибитор является структурным аналогом субстрата; в результате возникает конкуренция молекул субстрата и ингибитора за связывание с активным центром фермента. В этом случае с ферментом взаимодействует либо субстрат, либо ингибитор, образуя комплексы фермент-субстрат (ES) или фермент-ингибитор (EI). При формировании комплекса фермента и ингибитора (EI) продукт реакции не образуется (рис. 2.19).

Рис. 2.19. Схема конкурентного ингибирования активности фермента

Для конкурентного типа ингибирования справедливы следующие уравнения:

E + S ↔ES →E + P ; E + I ↔ EI.

Отличительной особенностью конкурентного ингибирования является возможность его ослабления при повышении концентрации субстрата, так как обратимый ингибитор не изменяет структуры фермента. Поэтому при высоких концентрациях субстрата скорость реакции не отличается от таковой в отсутствие ингибитора, т.е. конкурентный ингибитор не изменяет V max , но повышает K m .

Классическим примером конкурентного ингибирования является ингибирование сукцинатдегидрогеназной реакции малоновой кислотой (рис. 2.20). Малонат является структурным аналогом сукцината (наличие двух карбоксильных групп) и может также взаимодействовать с активным центром сукцинатдегидрогеназы. Однако перенос двух атомов водорода на простетическую группу FAD от малоновой кислоты невозможен и, следовательно, скорость реакции снижается.

Рис. 2.20. Пример конкурентного ингибирования сукцинатдегидрогеназы малоновой кислотой:

А - сукцинат связывается с активным центром фермента сукцинатдегидрогеназы за счет ионных связей; Б - в ходе ферментативной реакции происходит отщепление двух атомов водорода от сукцината с присоединением их к коферменту FAD. В результате образуется фумарат, который удаляется из активного центра сукцинатдегидрогеназы; В - малонат является структурным аналогом сукцината, он также связывается с активным центром сукцинатдегидрогеназы, но химическая реакция не идет

4. Многие лекарственные препараты оказывают свое терапевтическое действие по механизму конкурентного ингибирования. Например, реакция гидролиза ацетилхолина на холин и уксусную кислоту катализируется ферментом ацетилхолинэстеразой (АХЭ) (рис. 2.21) и может быть ингибирована в присутствии конкурентных ингибиторов этого фермента (например, прозерин, эндрофоний и др.) (рис. 2.22). При добавлении таких ингибиторов активность ацетилхолинэстеразы уменьшается, концентрация ацетилхолина (субстрата) увеличивается, что сопровождается усилением проведения нервного импульса. Конкурентные ингибиторы ацетилхолин-эстеразы используются при лечении мышечных дистрофий, а также для лечения двигательных нарушений после травм, параличей, полиомиелита.

Рис. 2.21. Реакция гидролиза ацетилхолина под действием АХЭ

Рис. 2.22. Связывание в активном центре АХЭ конкурентных ингибиторов

А - присоединение субстрата (ацетилхолина) в активном центре фермента.

Стрелкой указано место гидролиза ацетилхолина; Б - присоединение конкурентного ингибитора прозерина в активный центр фермента. Реакция не идет; В - присоединение конкурентного ингибитора эндрофония в активный центр фермента. Присоединение ингибиторов к активному центру АХЭ препятствует присоединению ацетилхолина

Другой пример лекарственных препаратов, механизм действия которых основан на конкурентном ингибировании фермента, - использование при заболеваниях поджелудочной железы (острые панкреатиты, некрозы) пептидных ингибиторов протеолитического фермента трипсина, таких какапротинин, трасилол, контрикал. Эти лекарственные препараты ингибируют трипсин, который высвобождается в окружающие ткани и кровь, и тем самым предотвращают нежелательные аутолитические явления при заболеваниях поджелудочной железы.

5. В некоторых случаях конкурентные ингибиторы, взаимодействуя с активным центром фермента, могут использоваться ими в качествепсевдосубстратов (антиметаболитов), что приводит к синтезу продукта с неправильной структурой. Полученные вещества не имеют «нужную» структуры и поэтому лишены функциональной активности. К таким лекарственным веществам относятся сульфаниламидные препараты.

6. Неконкурентным обратимым называют такое ингибирование ферментативной реакции, при котором ингибитор взаимодействует с ферментом в участке, отличном от активного центра. Неконкурентные ингибиторы не являются структурными аналогами субстрата; присоединение неконкурентного ингибитора к ферменту изменяет конформацию активного центра и уменьшает скорость ферментативной реакции, т.е. снижает ферментативную активность. Примером неконкурентного ингибитора может быть действие ионов тяжелых металлов, которые взаимодействуют с функциональными группами молекулы фермента, препятствуя катализу.

7. Необратимые ингибиторы снижают ферментативную активность в результате образования ковалентных связей с молекулой фермента. Чаще всего модификации подвергается активный центр фермента. В результате фермент не может выполнять каталитическую функцию.

Использование необратимых ингибиторов представляет больший интерес для выяснения механизма действия ферментов. Важную информацию о структуре активного центре фермента дают соединения, блокирующие определенные группы активного центра. Такие ингибиторы называютспецифическими. К специфическим ингибиторам причисляют диизопропилфторфосфат (ДФФ). ДФФ образует ковалентную связь с ОН-группой серина, содержащемся в активном центре фермента и принимающем непосредственное участие в катализе, поэтому ДФФ относят к специфическим необратимым ингибиторам «сериновых» ферментов (рис. 2.23). ДФФ используют с целью изучения структуры активного центра ферментов в энзимологии.

В отличие от специфических ингибиторов неспецифические ингибиторы образуют ковалентные связи с определенными группами фермента, расположенными не только в активном центре, но и в любом участке молекулы фермента. Например, ацетат йода (рис. 2.24) взаимодействует с любыми SH-группами белка. Такое взаимодействие изменяет конформацию молекулы фермента, а соответственно, и конформацию активного центра и снижает каталитическую активность.

Рис. 2.23. Специфическое ингибирование активности химотрипсина с помощью ДФФ

Рис. 2.24. Неспецифическое ингибирование активности фермента ацетатом йода.

Неспецифическое ингибирование происходит вследствие ковалентной модификации SH-групп цистеина молекулами ацетата йода

8. Примером лекарственного препарата, действие которого связано с необратимым ингибированием ферментов, является широко используемый аспирин. Действие этого противовоспалительного нестероидного препарата основано на ингибировании фермента циклооксигеназы, катализирующего реакцию образования простагландинов из арахидоновой кислоты. В результате ацетильный остаток аспирина присоединяется к свободной концевой ОН-группе серина одной из субъединиц циклооксигеназы (рис. 2.25). Тем самым блокируется образование простагландинов (см. модуль 8), которые обладают широким спектром биологических функций и в том числе являются медиаторами воспаления. Поэтому аспирин относят к противовоспалительным средствам. Ингибированные молекулы фермента разрушаются, синтез простагландинов восстанавливается только после синтеза новых молекул фермента.

Рис. 2.25. Механизм инактивации циклооксигеназы с помощью необратимого ингибитора - аспирина

При необратимом ингибировании происходит связывание или разрушение функциональных групп фермента, необходимых для проявления его активности.

Например, вещество диизопропилфторфосфат прочно и необратимо связывается с гидроксигруппой серина в активном центре фермента ацетилхолинэстеразы , гидролизующей ацетилхолин в нервных синапсах. Ингибирование этого фермента предотвращает распад ацетилхолина в синаптической щели, в результате чего медиатор продолжает оказывать воздействие на свои рецепторы, что бесконтрольно усиливает холинергическую регуляцию. Аналогичным образом действуют боевые фосфоорганические вещества (зарин, зоман) и инсектициды (карбофос, дихлофос).

Механизм необратимого ингибирования ацетилхолинэстеразы

Еще один пример связан с ингибированием ацетилсалициловой кислотой (аспирином) ключевого фермента синтеза простагландинов –циклооксигеназы . Эта кислота входит в состав противовоспалительных средств и используется при воспалительных заболеваниях и лихорадочных состояниях. Присоединение ацетильной группы к аминогруппе в активном центре фермента вызывает инактивацию последнего и прекращение синтеза простагландинов.

Механизм необратимого ингибирования циклооксигеназы

Обратимое ингибирование

При обратимом ингибировании происходит непрочное связывание ингибитора с функциональными группами фермента, вследствие чего активность фермента постепенно восстанавливается.

Примером обратимого ингибитора может служить прозерин , связывающийся с ферментом ацетилхолинэстеразой в ее активном центре. Группа ингибиторов холинэстеразы (прозерин, дистигмин, галантамин) используется при миастении, после энцефалита, менингита, травм ЦНС.

Конкурентное ингибирование

При таком виде ингибирования ингибитор по своей структуре похож на субстрат фермента. Поэтому он соперничает с субстратом за активный центр, что приводит к уменьшению связывания субстрата с ферментом и нарушению катализа. В этом состоит особенность конкурентного ингибирования – возможность усилить или ослабить ингибирование через изменение концентрации субстрата.

Например:

1. Конкурентное взаимодействие этанола и метанола за активный центр алкогольдегидрогеназы .

2. Ингибирование сукцинатдегидрогеназы малоновой кислотой , структура которой схожа со структурой субстрата этого фермента – янтарной кислоты (сукцината).

Изменение каталитической эффективности ферментов

Индуцируемыми, как правило, являются ферменты с катаболической функцией. Их образование может быть вызвано или ускорено субстратом данного фермента. Репрессируемыми обычно бывают ферменты анаболической направленности. Ингибитором (репрессором) синтеза этих ферментов может быть конечный продукт данной ферментативной реакции.

Этот тип регуляции может осуществляться по нескольким механизмам.

Влияние активаторов и ингибиторов на активность ферментов

Активаторы разными путями могут повышать ферментативную активность:

Формируют активный центр фермента;

Облегчают образование фермент-субстратного комплекса;

Стабилизируют нативную структуру фермента;

Защищают функциональные группы активного центра.

Классификация ингибиторов ферментов :

1. Неспецифические.

2. Специфические:

а) необратимые

б) обратимые:

Конкурентные

Неконкурентные.

Неспецифические ингибиторы вызывают денатурацию молекулы фермента – это кислоты, щелочи, соли тяжелых металлов. Их действие не связано с механизмом ферментативного катализа.

Необратимое ингибирование наблюдают в случае образования ковалентных стабильных связей между молекулой ингибитора и фермента. Чаще всего модификации подвергается активный центр фермента. В результате фермент не может выполнять каталитическую функцию.

К необратимым ингибиторам относят ионы тяжёлых металлов, например ртути (Hg 2+), серебра (Ag +) и мышьяка (As 3+), которые в малых концентрациях блокируют сульфгидрильные группы активного центра. Субстрат при этом не может подвергаться химическому превращению.

Диизопропилфторфосфат (ДФФ) специфически реагирует лишь с одним из многих остатков серина в активном центре фермента. Остаток Сер, способный реагировать с ДФФ, имеет идентичное или очень сходное аминокислотное окружение. Высокая реакционная способность этого остатка по сравнению с другими остатками Сер обусловлена аминокислотными остатками, также входящими в активный центр ферментов.

ДФФ относят к специфическим необратимым ингибитором «сериновых» ферментов, так как он образует ковалентную связь с гидроксильной группой серина, находящегося в активном центре и играющего ключевую роль в процессе катализа.

Монойодуксусная кислота , п-хлормеркурибензоат легко вступают в реакции с SH-группами остатков цистеина белков. Эти ингибиторы не относят к специфичным, так как они реагируют с любыми свободными SH-группами белков и называются неспецифическими ингибиторами. Если SH-группы принимают участие непосредственно в катализе, то с помощью этих ингибиторов представляется возможным выявление роли SH-групп фермента в катализе.

Необратимые ингибиторы ферментов как лекарственные препараты

Пример лекарственного препарата, действие которого основано на необратимом ингибировании ферментов, - широко используемый препарат аспирин . Противовоспалительный нестероидный препарат аспирин обеспечивает фармакологическое действие за счёт ингибирования фермента циклооксигеназы , катализирующего реакцию образования простагландинов из арахидоновой кислоты. В результате химической реакции ацетильный остаток аспирина присоединяется к свободной концевой ОН-группе серина циклооксигеназы.

Это вызывает снижение образования продуктов реакции простагландинов, которые обладают широким спектром биологических функций, в том числе являются медиаторами воспаления.

Необратимые ингибиторы ферментов как лекарственные препараты

Обратимое ингибирование

Обратимые ингибиторы связываются с ферментом слабыми нековалентными связями и при определённых условиях легко отделяются от фермента. Обратимые ингибиторы бывают конкурентными и неконкурентными.

Конкурентное ингибирование

К конкурентному ингибированию относят обратимое снижение скорости ферментативной реакции, вызванное ингибитором, связывающимся с активным центром фермента и препятствующим образованию фермент-субстратного комплекса. Такой тип ингибирования наблюдают, когда ингибитор – структурный аналог субстрата, в результате возникает конкуренция молекул субстрата и ингибитора за место в активном центре фермента. В этом случае с ферментом взаимодействует либо субстрат, либо ингибитор, образуя комплексы фермент-субстрат (ES) или фермент-ингибитор (EI). При формировании комплекса фермента и ингибитора (EI) продукт реакции не образуется.

Классический пример конкурентного ингибирования – ингибирование сукцинатдегидрогеназной реакции малоновой кислотой. Малоновая кислота – структурный аналог сукцината (наличие двух карбоксильных групп) и может также взаимодействовать с активным центром сукцинатдегидрогеназы. Однако отщепление двух атомов водорода от малоновой кислоты невозможно; следовательно, скорость реакции снижается.

Типы ингибирования

Ингибиторы способны взаимодействовать с ферментами с разной степенью прочности. Если ингибитор вызывает стойкие изменения пространственной третичной структуры молекулы фермента или модификацию функциональных групп фермента, то такой тип ингибирования называется необратимым. Чаще, однако, имеет место обратимое ингибирование.

Обратимое ингибирование

Обратимые ингибиторы связываются с ферментом слабыми нековалентными связями и при определённых условиях легко отделяются от фермента. Различают три типа обратимого ингибирования ферментов: конкурентное, неконкурентное и бесконкурентное.

1. Конкурентное ингибирование

Конкурентный ингибитор конкурирует с субстратом за связывание с активным центром, но в отличие от субстрата связанный с ферментом конкурентный ингибитор не подвергается ферментативному превращению. Отличительная особенность конкурентного ингибирования состоит в том, что его можно устранить или ослабить, просто повысив концентрацию субстрата.

Конкурентное ингибирование может быть вызвано веществами, имеющими структуру, похожую на структуру субстрата, но несколько отличающуюся от структуры истинного субстрата. Такое ингибирование основано на связывании ингибитора с субстрат связывающим (активным) центром.

Рис. 2. Общий принцип конкурентного ингибирования (схема по В.Л. Кретовичу). Е - фермент; S - субстрат; Р 1 и Р 2 - продукты реакции; I - ингибитор

В общей форме реакция взаимодействия ингибитора с ферментом может быть представлена следующим уравнением:

Образовавшийся комплекс, называемый фермент-ингибиторным комплексом ЕI, в отличие от фермент-субстратного комплекса ES не распадается с образованием продуктов реакции.

Лекарственные препараты как конкурентные ингибиторы

Многие лекарственные вещества ингибируют ферменты человека и животных по конкурентному типу. Например, что для лечения некоторых инфекционных заболеваний, вызываемых бактериями, применяют сульфаниламидные препараты. Оказалось, что эти препараты имеют структурное сходство с парааминобензойной кислотой, которую бактериальная клетка использует для синтеза фолиевой кислоты, являющейся составной частью ферментов бактерий. Благодаря этому структурному сходству сульфаниламид блокирует действие фермента путем вытеснения парааминобензойной кислоты из комплекса с ферментом, синтезирующим фолиевую кислоту, что ведет к торможению роста бактерий.

Антиметаболиты как лекарственные препараты

В качестве ингибиторов ферментов по конкурентному механизму в медицинской практике используют вещества, называемые антиметаболитами. Эти соединения, будучи структурными аналогами природных субстратов, вызывают конкурентное ингибирование ферментов, с одной стороны, и, с другой - могут использоваться этими же ферментами в качестве псевдо субстратов, что приводит к синтезу аномальных продуктов. Аномальные продукты не обладают функциональной активностью; в результате наблюдают снижение скорости определённых метаболических путей.

Таким образом, можно конструировать лекарственные вещества, ингибирующие ферменты по конкурентному типу. Чтобы быть эффективным, ингибитор должен иметь высокое сродство к ферменту. В противном случае необходимо назначать большие дозы лекарственных препаратов, чтобы активно конкурировать с эндогенным субстратом за активный центр фермента (В.П. Комов, В.Н. Шведова, 2004).

2. Неконкурентное ингибирование

Неконкурентное ингибирование тоже обратимо, но не может быть ослаблено или устранено повышением концентрации субстрата

В случае неконкурентного ингибирования ингибитор присоединяется к ферменту не в активном центре, где связывается субстрат, а совсем в другом месте. При этом кон формация молекулы фермента изменяется таким образом, что происходит обратимая инактивация его каталитического центра. Неконкурентные ингибиторы связываются обратимо как со свободным ферментом, так и с комплексом ES, образуя неактивные комплексы EI и ESI.

Степень торможения во многих случаях определяется продолжительностью действия ингибитора на фермент. При данном типе ингибирования благодаря образованию стабильной ковалентной связи фермент часто подвергается полной инактивации, и тогда торможение становится необратимым (Н.З. Хазипов, А.Н. Аскарова, 2001).

Наиболее важные неконкурентные ингибиторы представляют собой образующиеся в живых организмах промежуточные продукты метаболизма, способные обратимо связываться со специфическими участками на поверхности некоторых регуляторных ферментов и изменять при этом активность их каталитических центров. Примером может служить ингибирование L-треониндегидратазы L-изолейцином (А. Ленинджер, 1985).

Примером необратимого ингибирования является действие йодацетата, ДФФ, а также диэтил-n-нитрофенилфосфата и солей синильной кислоты. Это действие заключается в связывании и выключении функциональных групп или ионов металлов и молекуле фермента.

Следует указать, что неконкурентное ингибирование также может быть обратимым и необратимым, поскольку отсутствует конкуренция между субстратом и ингибитором за активный центр. Примеры необратимого ингибирования приведены ранее. При обратимом неконкурентном ингибировании субстрат S и ингибитор I связываются с разными центрами, поэтому появляется возможность образования как комплекса EI, так и тройного комплекса EIS; последний может распадаться с освобождением продукта, но с меньшей скоростью, чем комплекс ES.

Этот тип неконкурентного ингибирования чаще всего наблюдается у ферментов, катализирующих превращения более одного субстрата, когда связывание ингибитора не блокирует связывание субстрата с активным центром. Ингибитор при этом соединяется как со свободным ферментом, так и с ES-комплексом (Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин, 1990).

3. Бесконкурентное ингибирование

В редких случаях степень торможения активности фермента может увеличиваться с повышением концентрации субстрата. Для этого типа торможения был предложен термин "бесконкурентное ингибирование".

Бесконкурентное ингибирование имеет место, когда ингибитор взаимодействует с ферментом только в составе фермент-субстратного комплекса, препятствуя его распаду (Уэбб Л., 1966).

Примером необратимого действия ингибиторов на ферменты могут служить фосфорорганические вещества, применяемые в качестве инсектицидов.

При бесконкурентном ингибировании ингибитор связывается только с фермент-субстратным комплексом, но не со свободным ферментом. Субстрат, связываясь с ферментом, изменяет его конформацию, что делает возможным связывание с ингибитором. Ингибитор, в свою очередь, так меняет конформацию фермента, что катализ становится невозможным

Один из механизмов такого торможения обусловлен возможностью соединения ингибитора с комплексом ES с образованием неактивного или медленно реагирующего тройного комплекса EIS (Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин, 1990).

Ингибирование субстратом -- частный случай бесконкурентного ингибирования, когда две молекулы субстрата связываются с ферментом, что препятствует образованию продукта

Активность многих ферментов тормозится избытком субстрата, причем имеется несколько механизмов этого процесса.

1) Если в образовании фермент-субстратного комплекса участвует несколько функциональных групп фермента, то возможно одновременное присоединение к активному центру двух или более субстратов, что однозначно приведет к образованию неактивного комплекса.
2) В случае избытка субстрата возможно его присоединение не только к активному центру, но и к другим химическим группировкам, функционально связанным с активным центром. Такого рода взаимодействие может помешать ферментативной реакции.
3) Увеличение концентрации субстрата может повысить ионную силу реакционной среды и, как следствие, затормозить скорость ферментативной реакции.

Торможение продуктами реакции связано с тем, что они могут связываться с ферментом или с каким-либо другим компонентом системы таким образом, что скорость прямой реакции снижается.